細(xì)胞簡(jiǎn)介：

產(chǎn)品名稱 人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞

組織來(lái)源 皮膚組織

產(chǎn)品規(guī)格 5×10^5Cells/T25

細(xì)胞簡(jiǎn)介 人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分離自皮膚組織；表皮位于動(dòng)物皮膚的外層，由胚胎時(shí)期外胚層形成，具有抗摩擦和抗損傷的作用。表皮是皮膚的淺層結(jié)構(gòu)，由復(fù)層扁平上皮構(gòu)成。從基底層到表面可分為五層，即基底層、棘層、顆粒層、透明層和角質(zhì)層。依據(jù)細(xì)胞的分化狀態(tài)、功能類型可以分為多種細(xì)胞類型，表皮角化上皮細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞核心細(xì)胞群體本質(zhì)是同一細(xì)胞群體，前者從“表皮屬角化復(fù)層扁平上皮"的組織屬性命名，后者從“合成角蛋白、執(zhí)行角化功能"的功能特征命名，二者均涵蓋表皮從基底層增殖細(xì)胞到角質(zhì)層終末細(xì)胞的全分化譜系，且占表皮細(xì)胞總量超90%，是表皮屏障功能的核心載體。在這一分化譜系中，存在明確的階段差異：基底層細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞的“增殖源頭"，呈柱狀、有完整活性細(xì)胞核，以K5、K14、Ki-67、干細(xì)胞標(biāo)志物p63為核心，無(wú)角化相關(guān)蛋白，未啟動(dòng)角化，一般描述為角化形成細(xì)胞/角質(zhì)形成細(xì)胞/角化上皮細(xì)胞等；當(dāng)細(xì)胞遷移至棘層中上部至顆粒層，成為“角化細(xì)胞"——這是仍含固縮細(xì)胞核（但細(xì)胞器減少）的中間活細(xì)胞，能主動(dòng)合成角蛋白與絲聚蛋白前體，處于“正在角化"的執(zhí)行階段，表達(dá)切換為K1、K10為主，同時(shí)表達(dá)絲聚蛋白前體（絲聚合蛋白原，顆粒層特征）、轉(zhuǎn)酶1（TG1，促進(jìn)角蛋白交聯(lián)），Ki-67陰性；終角化細(xì)胞進(jìn)一步退化，在角質(zhì)層形成“角質(zhì)細(xì)胞"（角質(zhì)層終末細(xì)胞），這是無(wú)細(xì)胞核、無(wú)細(xì)胞器的終末細(xì)胞，胞質(zhì)充滿交聯(lián)角蛋白纖維，通過(guò)細(xì)胞間連接構(gòu)成表皮物理屏障，無(wú)核相關(guān)標(biāo)志物，以終末成熟標(biāo)志物兜甲蛋白、小富脯蛋白（SPRRs）為特征，K1、K10持續(xù)存在但無(wú)活性合成功能；PCNA是增殖細(xì)胞的標(biāo)志物，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞在基底層（增殖活躍區(qū)）可能表達(dá)PCNA，而終末分化層（角質(zhì)層）可能不表達(dá)，細(xì)胞在不同增殖狀態(tài)表達(dá)量不一樣；這四種細(xì)胞的核心差異在于分化階段（全階段/中間態(tài)/終末態(tài)）、形態(tài)（核與細(xì)胞器有無(wú)/活性）及功能（增殖/合成/屏障），且存在“角質(zhì)形成細(xì)胞（表皮角化上皮細(xì)胞）包含角化細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞"的邏輯關(guān)系。表皮也包含其他非角化上皮細(xì)胞：黑色素細(xì)胞（Melanocytes）、朗格漢斯細(xì)胞（Langerhanscells）、Merkel細(xì)胞等。

方法簡(jiǎn)介 實(shí)驗(yàn)室分離的人表皮角質(zhì)形成層細(xì)胞先消化、后-膠原酶混合消化法制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10? cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室分離的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)K5免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

產(chǎn)品信息：

培養(yǎng)信息：

自備試劑： 0.25%  、鼠尾膠原蛋白Ⅰ型（1×）或鼠尾膠原蛋白Ⅰ型（1 mg/mL）  、PBS  、培養(yǎng)基

包被條件： 鼠尾膠原Ⅰ（2-5 μg/cm2）

培養(yǎng)基： 人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等)

換液頻率： 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性： 貼壁

細(xì)胞形態(tài)： 上皮細(xì)胞樣

傳代比例： 1:2

傳代特性： 可傳1-2代

消化液：0.25%

凍存步驟：

凍存前準(zhǔn)備?

確保細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，密度達(dá)80%-90%?。

配制凍存液：推薦50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+10%DMSO?。

?細(xì)胞處理?

棄去培養(yǎng)上清，用PBS潤(rùn)洗1-2次?。

加入消化后，用含血清的培養(yǎng)基終止消化。

?凍存操作?

離心（1000RPM，3-4分鐘）后棄上清，用凍存液重懸細(xì)胞?。

分裝至凍存管（每管1mL，細(xì)胞數(shù)100-400萬(wàn)）?。

4℃靜置10分鐘，-20℃ 2小時(shí)，-80℃過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮?。

公司正在出售的產(chǎn)品：

操作實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 原代細(xì)胞分離

?組織獲取?：采用成年SD大鼠，快速取出海馬或脊髓組織，置于低溫人工腦脊液（0-4℃）中保存?。

?消化與離心?：使用木瓜蛋白酶消化組織，通過(guò)Optiprep不連續(xù)梯度離心，收集組織細(xì)胞密集帶?。

?細(xì)胞培養(yǎng)?：將細(xì)胞懸液接種于含B27添加劑和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF-2）的培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)?。

2. 細(xì)胞純化

?差速貼壁法?：通過(guò)搖床分離（200r/min去除小膠質(zhì)細(xì)胞，280r/min收集少突前體細(xì)胞）?。

?免疫磁珠分選?：利用NG2抗體標(biāo)記后通過(guò)磁珠分選，提高純度?。

3. 細(xì)胞傳代與凍存

?傳代?：使用含EDTA和DNase I的消化液處理細(xì)胞，按1:3比例傳代?。

?凍存?：將細(xì)胞重懸于凍存液（含10% DMSO和90%胎牛血清），程序降溫后保存于液氮中?。

4. 功能驗(yàn)證

?免疫熒光染色?：檢測(cè)NG2、GFAP等標(biāo)志物表達(dá)，確認(rèn)細(xì)胞純度?。

?電生理記錄?：通過(guò)膜片鉗技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞電特性（如鈉電流）。